底物水平磷酸化指高能化合物的放能水解作用或与基团转移相偶联的ATP合成作用。不包括光合磷酸化或呼吸链中氧化磷酸化的ATP生成过程。例如：糖酵解途径中产生的高能磷酸化合物甘油酸-1，3-二磷酸和烯醇式磷酸丙酮酸在酶的作用下，高能磷酸基团转移到ADP分子上生成ATP。又如三羧酸循环中产生的高能硫酯化合物琥珀酰辅酶A在酶的作用下水解成琥珀酸，同时使GDP磷酸化为GTP，GTP再与ADP作用生成ATP。这些都是底物水平磷酸化的实例。底物水平磷酸化没有共同的作用机制。