不可逆抑制剂通常以共价键方式与酶的必需基团进行结合，一经结合很难自发解离，不能用透析或超滤等物理方法解除抑制。例如，有机磷杀虫剂能专一地作用于胆碱酯酶活性中心的丝氨酸残基，使其磷酰化而破坏酶的活性中心，导致酶的活性丧失，使胆碱能神经末梢分泌的乙酰胆碱不能及时分解，过多的乙酰胆碱蓄积导致胆碱能神经过度兴奋，以致昆虫失去知觉，起到杀虫作用。