当在规定时间内反应介质中的抗体应将待测抗原全部结合，无游离抗原存在，此时再次加入已知相应抗原，该抗原与剩余游离抗体结合，而出现第二个峰值信号，故证明第一峰值信号是由全部待测抗原产生。反之，不出现第二次峰值信号说明待测标本中抗原浓度过高，应进一步稀释后测量。