第十四章 基因重组与基因工程

　　一、自然界的基因转移和重组：

　　基因重组(gene recombination)是指DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。

　　1.接合作用：当细胞与细胞相互接触时，DNA分子即从一个细胞向另一个细胞转移，这种遗传物质的转移方式称为接合作用(conjugation)。

　　2.转化和转染：由外来DNA引起生物体遗传性状改变的过程称为转化(transformation)。噬菌体常常可感染细菌并将其DNA注入细菌体内，也可引起细菌遗传性状的改变。通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfection)。转染是转化的一种特殊形式。

　　3.整合和转导:外来DNA侵入宿主细胞，并与宿主细胞DNA进行重组，成为宿主细胞DNA的一部分，这一过程称为整合。整合在宿主细胞染色体DNA中的外来DNA，可以被切离出来，同时也可带走一部分的宿主DNA，这一过程称为转导(transduction)。来源于宿主DNA的基因称为转导基因。

　　4.转座：转座又称为转位(transposition)，是指DNA的片段或基因从基因组的一个位置转移到另一个位置的现象。这些能够在基因组中自由游动的DNA片段包括插入序列和转座子两种类型。

　　⑴插入序列：典型的插入序列(insertion sequence，IS)是长750-1500bp的DNA片段，由两个分离的反向重复序列和一个转座酶基因。当转座酶基因表达时，即可引起该序列的转座。其转座方式主要有保守性转座和复制性转座。

　　⑵转座子：转座子(transposons)是可从一个染色体位点转移到另一个位点的分散的重复序列，含两个反向重复序列、一个转座酶基因和其他基因(如抗生素抗性基因)。

　　免疫球蛋白重链基因由一组可变区基因(VH)和一组恒定区基因(CH)构成，通过这些基因的选择性转座和重组，就可以转录表达出各种各样的免疫球蛋白重链，以对付不同的抗原。

　　5.基因重组的方式：

　　⑴位点特异性重组：在整合酶的催化下，两段DNA序列的特异的位点处发生整合并共价连接，称为位点特异性重组。

　　⑵同源重组：发生在同源DNA序列之间的重组称为同源重组(homologous recombination)。这种重组方式要求两段DNA序列类似，并在特定的重组蛋白或酶的作用下完成。

　　二、重组DNA技术：

　　重组DNA技术又称为基因工程(genetic engineering)或分子克隆(molecular cloning)，是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。

　　1.载体和目的基因的分离(分)：对载体DNA和目的基因分别进行分离纯化，得到其纯品。

　　⑴载体：常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。①质粒：是存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的双链环状DNA，具有独立复制的能力，通常带有细菌的抗药基因。②噬菌体：可通过转染方式将其DNA送入细菌体内进行增殖。常用的为人工构建的λ噬菌体载体，当目的基因与噬菌体DNA进行重组时，可采用插入重组方式，也可采用置换重组方式。③病毒：常用的为SV40，通过感染方式将其DNA送入哺乳动物细胞中进行增殖。

　　⑵目的基因：①直接从染色体DNA中分离：仅适用于原核生物基因的分离。②人工合成：根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。③从mRNA合成cDNA：采用一定的方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催化合成其互补DNA(cDNA)，除去RNA链后，再用DNA聚合酶合成其互补DNA链，从而得到双链DNA。④从基因文库中筛选：将某一种基因DNA用适当的限制酶切断后，与载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组DNA的种群，称为G文库(genomic DNA library)。将某种细胞的全部mRNA通过逆转合成cDNA，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNA library)。C-文库具有组织细胞特异性。⑤利用PCR合成：如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)技术，在体外合成目的基因。

　　2.载体和目的基因的切断(切)：通常采用限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)，简称限制酶，分别对载体DNA和目的基因进行切断，以便于重组。能够识别特定的碱基顺序并在特定的位点降解核酸的核酸内切酶称为限制酶。限制酶所识别的顺序往往为4-8个碱基对，且有回文结构。由限制酶切断后的末端可形成平端、3'-突出粘性末端和5'-突出粘性末端三种情况。形成粘性末端(cohesive end)者较有利于载体DNA和目的基因的重组。

　　3.载体和目的基因的重组(接)：即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的DNA分子。

　　⑴粘性末端连接法：载体与目的基因通过粘性末端进行互补粘合，再加入DNA连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。

　　⑵人工接尾法：即同聚物加尾连接法。在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3'-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，通过碱基互补进行粘合后，再由DNA连接酶连接。

　　⑶人工接头连接法：将人工连接器(即一段含有多种限制酶切点的DNA片段)连接到载体和目的基因上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。

　　4.重组DNA的转化和扩增(转)：将重组DNA导入宿主细胞进行增殖或表达。重组质粒可通过转化方式导入宿主细胞，λ噬菌体作为载体的重组体，则需通过转染方式将重组噬菌体DNA导入大肠杆菌等宿主细胞。重组DNA导入宿主细胞后，即可在适当的培养条件下进行培养以扩增宿主细胞。

　　5.重组DNA的筛选和鉴定(筛)：对含有重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定。

　　⑴根据重组体的表型进行筛选：对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭活法进行筛选。

　　⑵根据标志互补进行筛选：当宿主细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷时，可采用此方法筛选重组体。即在载体DNA分子中插入相应的缺陷基因，如宿主细胞重新获得缺陷基因的表达产物，则说明该细胞中带有重组体。

　　⑶根据DNA限制酶谱进行分析：经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行限制酶谱分析进一步鉴定。

　　⑷用核酸杂交法进行分析鉴定：采用与目的基因部分互补的DNA片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，以确定重组体中带目的基因。

　　获得带目的基因的细菌后，可将其不断进行增殖，从而得到大量的目的基因片段用于分析研究。如在目的基因的上游带有启动子顺序，则目的基因还可转录表达合成蛋白质